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本试剂盒是通过测量Caspase 3/7的活性而用于细胞凋亡检测的。因为Caspase-3 (CPP32/apopain)在细胞凋亡的起始过程中发挥着重要作用，因此其作为一个值得信赖的细胞凋亡指示剂广泛地被大家所接受。Caspase 3具有特异性的底物多肽识别序列，即天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(DEVD)。

本试剂盒用TF2-DEVD-FMK作为荧光指示剂，用于Caspase-3/7活性的检测。TF2-DEVD-FMK具有细胞渗透性、无细胞毒性，在凋亡细胞中能与活化的casepase-3/7进行不可逆的结合。一旦与Caspases结合，这种绿色荧光染料会被保留在细胞中。这种结合可以阻止Caspases进一步的催化作用，但是不会使细胞凋亡的进程停止。这种试剂将在添加介质之后的15分钟内与有活性的Caspase酶进行反应。本试剂盒提供所有必需组分和最佳检测方案。它用来对凋亡细胞中绝大多数活化的Caspases的活性进行定量检测，或者用来筛选Caspases抑制剂。这种绿色荧光可以通过流式细胞仪对被激活的Caspases进行直接检测。

组分	规格
组分A:200×Caspase 3/7 Substrate	2×50μL
组分B:Assay Buffer	20mL

保存：-20℃避光，避免反复冻融。


最佳的诱导条件，根据细胞类型、细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素而决定。

• 准备细胞
  
  • 贴壁细胞：对于96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；过夜培养备用；
    
  • 悬浮细胞：离心收集细胞，并重悬细胞，对于用多聚D-赖氨酸包被过的96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对用多聚D-赖氨384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；800rpm，2min，离心，备用；
• 准备caspase 3/7检测缓冲液
  
  • 使用前该试剂盒需要在室温解冻。
    
  • caspase 3/7检测缓冲液的制备：
    将50μL 200×Caspase 3/7 Substrate (组分A)加入10mL Assay Buffer (组分B)，混匀；
• 检测方法
  
  • 样品处理组：对于96孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成10×待检药物溶液，每孔加入10μL待检测药物；对于384孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成5×待检药物溶液，每孔加入5μL待检测药物；空白对照组（不含细胞的培养基）：加入相应体积的药物配制所需缓冲液；
    
  • 在37℃，5%CO2，培养箱中孵育细胞板达所需时间诱导细胞凋亡（用喜树碱处理的Jurkat细胞4～6小时）。
    
  • 对于96孔板，每孔加入100μL caspase 3/7检测缓冲液；对于384孔板，每孔加入25μL caspase 3/7检测缓冲液（即2b步骤配制所得溶液）；
    注意：如果需要，加入1μL 1mM Ac-DEVD-CHO caspase 3/7抑制剂到到样品中，10分钟后再加入caspase 3/7检测缓冲液，以抑制caspase 3/7-样酶激活。
    
  • 加入caspase 3/7检测缓冲液后，避光室温孵育至少1小时；
    
  • 800rpm，2min，离心细胞板，悬浮细胞一定要离心；
    
  • 检测Ex/Em = 490/525nm处的荧光强度。

处理组测量的荧光强度值减去空白对照组测量的荧光强度值；空白对照组测量的荧光强度值受到培养液中生长因子或者细胞版的材质等影响。

图1.检测Jurkat细胞中Caspase3/7活性。将Jurkat细胞同时接种于一个96孔板中（Costar），80,000 cells/90μL/孔。用喜树碱（终浓度为20μM）处理Jurkat细胞，未处理组作为空白对照，处理时间为5小时。处理组和空白对照组加入或不加caspase 3/7抑制剂AC-DEVD-CHO (5μM)处理10分钟。每孔加入100μL caspase 3/7检测缓冲液，室温孵育1小时。使用NOVOStar仪器(BMG Labtech)测量荧光强度，Ex/Em = 490/525nm。
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